纳米PCR试剂盒

PCR简介

核酸聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种在体外模拟自然DNA复制的核酸扩增技术，由K. Mullis于1985年发明， 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一特异性DNA片段于数小时内扩增至百万倍，可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中、一个分子扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR技术的发明是分子生物学的一项革命。在人类基因组计划、后基因组计划、基因芯片技术、各类新药特药的开发研究等，PCR技术和试剂几乎无处不在。已有一系列PCR方法被设计出来，广泛应用于整个生命科学研究中，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。

PCR试剂的市场巨大，它与分子克隆和核酸序列分析几乎构成了整个现代分子生物学实验工作的基础。据前线战略管理咨询公司的一份新的综合报告，到2010年，包括PCR在内的核酸测试将产生160多亿美元的产值。而在2000年，全世界核酸试剂市场刚刚超过15亿美元，只占全部体外诊断市场的8%。核酸试剂是直接针对遗传物质（DNA或RNA）的试剂，它们是体外诊断更大市场的一部分。体外诊断市场的定义是测试体液或组织，用来发现、诊断或管理医疗状况的所有装置和技术。核酸试剂1985年起问世，主要用来诊断传染病，这些病的目标生物DNA序列已为人们了解。聚合酶链式反应（PCR）放大程序和荧光原位杂交（FISH）检测技术等技术的推出和商业化使核酸试剂能够进入其他领域。法医学及产前遗传诊断是从传统方法转而应用核酸试剂方法的两个重要领域，市场应用前景巨大。癌症以及心血管、呼吸和神经系统疾病与基因息息相关，PCR技术被开发用来检测研究这些基因。 现今从核酸试剂获益的市场部门主要是心血管和肿瘤。心血管是目前人类死亡的主要原因之一，肿瘤是因为这一疾病的本质（细胞分裂失控），使它本身要接受核酸检测。

尽管目前PCR反应已发展成为一项成熟技术，常规实验中失误率较低，但实际操作中，进行PCR扩增始终存在一些需要改进的问题。最突出的问题有三个： 一 PCR始终存在着不同程度的非特异性扩增。对PCR反应来说，酶体系和buffer体系的组成直接影响到扩增的效率、产量及特异性。 二 在各类利用PCR进行基因扩增的实际实验研究中，有接近10-20%的DNA序列很难被扩增出来,即使反复优化PCR条件也不能获得足够量的符合要求的目标序列。人类基因组中就有大量的这类序列。扩增困难将严重制约基因组技术的研究和大量基因功能的研究。 三 核酸检测灵敏度高成本低，但尚未成为临床广泛使用的技术手段。PCR早期被认为可以大规模地在临床诊断上使用并成为标准，虽然原则上接近单个分子的DNA也可以被扩增出来，由于实际样品的复杂性和各种抑制剂的存在，有相当比例的PCR扩增难以保证其较高的重复性。实际临床检测条件下（血液、尿液等样品）DNA稳定扩增的难度也比较大。如何实现稳定的高灵敏度扩增，一直是需要改进的。只有少量类似实验室研究性质的应用领域如亲子鉴定和法医使用PCR技术。

完成PCR反应的两个重要部分，一个是PCR仪器，目前受国际专利保护；另一个是PCR试剂，主要包括酶和buffer，其中一种主要的酶-Taq酶的专利已经到期，生产不再受限，但各商业供应的酶体系及buffer体系均不大相同，配方处于半保密状态。巨大的市场需求对核酸试剂和PCR技术提出了很高的要求，而传统的PCR优化剂只能解决一部分问题，许多技术空白急需填补。在基因组学研究领域和生物医学研究诊断领域特别需要能（同时）解决上述三个问题(超高灵敏度,高特异性,高稳定性)的新一代PCR技术。

PCR技术研究现状

目前国际上基因扩增技术面临一个情况：大量的实验室在日常研究中都会遇到相当数量的方式不一的基因扩增困难，一般情况下某一段基因如果反复尝试不同方案还是不能扩增出来的话，要么走纯化学合成的方法（合成长片断基因相当困难），要么暂停或放弃对该段基因的扩增。 大的基因组研究中心在克隆DNA片段时，如果方法流程中包含基因扩增的步骤，将会遇到很多基因片段无法克隆，原因之一是对应的DNA序列很难扩增或扩增效果很差。这促使人们去开发基于很少量DNA样本的测序技术。总体看来，大的基因组测序中心可能对基因扩增效率的依赖性短期内没有增加，而成千上万的生物和医药的研究室和实验室更多是研究基因的功能,非常需要更好的基因扩增技术。

另外，人类基因组和水稻基因组以及所有大型基因组中都含有相当数量的未知序列，或者叫做GAP区，是基因组计划中使用现有技术很难完成的部分，所以空白在那里。GAP区在基因组中占的比例不高（1-5%左右），但是大型基因组的基数很大，完成这些GAP区也将越来越重要。这些序列的大规模获得将需要更高的基因操作技术。

纳米PCR的优势

纳米材料与DNA结合的若干基础研究国外做得比较多，目前利用纳米材料的独特的催化性能或与诸多分子（蛋白质、核酸，有机小分子等）的结合性能国内外正在开展大量的应用技术研究，国内的若干研究室已经作出了出色的工作。但是纳米材料能够在一般基因扩增技术无能为力或效率不高的情况下扩增出来目的DNA，并且明显增加了扩增专一性和灵敏度，是在国际上首次发现。目前我们是纳米基因扩增技术研究的领先者之一。由于基因扩增技术属于上百个DNA技术中的主要技术环节，一旦它具备了把绝大部分现行PCR技术升级换代的优势，它将进入核酸试剂巨大的国际市场，应用价值相当可观。通过本研究我们应该比较清楚纳米材料催化基因扩增的若干机制，极有可能在此基础上研制出更好的基因操作技术。

我们在研究纳米PCR机制的基础上，重点加强纳米基因扩增技术在完整基因扩增中的应用，使用上述三个指标(特异性、灵敏度以及稳定性)来衡量纳米基因扩增技术以及它与其他分子生物学技术相结合的组合技术，能否解决不同长度的基因组完整基因序列在扩增时同样面临的这三个问题。我们还将直接使用血液和尿液作为基因组DNA的存在条件来考察纳米PCR与一般PCR在上述指标上的比较研究。 另外，由于基因组技术(不是一般意义上的基因技术)越来越重要,研究基因时不能像以前一般主要注意基因所转录出来的mRNA或mRNA对应的cDNA了,包含基因内所有调控等信息的DNA 片段越来越多地被研究，它们需要在一起被扩增,即完整基因的扩增将愈发重要。当然基因间的非编码区序列被认为甚至更重要,它们也越来越多地需要被扩增出来加以研究. 初步研究表明纳米基因扩增技术在扩增10-15kb长度的长片段DNA时比一般PCR技术有明显优势。我们正在设计人类基因组第21号染色体上全部基因（533个）的对比扩增实验，先扩增几十个基因，从统计上确立纳米基因扩增在基因组中完整基因大规模扩增的技术优势；在上述研究基础上建立初步通用的完整基因扩增方案。通过上述研究，希望纳米基因扩增技术能够成为解决生物医学研究和应用领域中基因扩增之特异性、高灵敏度和稳定性（或三个指标之一）等重大问题的关键技术。

基因扩增技术发明了二十多年，直到2004年专利过期，其技术水平也没有达到对扩增结果的可预测程度。但是PCR技术体系并不能被认为是很复杂的反应体系，至少其组成就是DNA模板、引物、聚合酶、dNTPs及缓冲系统，不能算是很复杂的体系。 我们认为应该可以实现扩增结果的可预测性。目前的PCR引物设计软件已经比较成熟。我们选取PRIMER3.1 进行设计，利用TAQ酶和PFU酶系统一次扩增一批序列，把实验结果分为一次扩增成功和一次扩增失败。国内外每天应用PCR技术的实验室何止成千上万，如果PCR技术可以预测结果，将节约大量实验成本并开辟一个巨大的市场。

纳米PCR产品可以作为现有市场PCR产品的有利补充，广大的PCR试剂使用者手上将陆续又多出一批增加基因扩增成功率的好帮手。今后几年内研制出来一批既有自主知识产权又有实用价值的纳米PCR试剂（盒），推动纳米生物技术的应用发展。

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